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==ダイズの形質転換==

* 出典：農業生物資源研究所　ダイズゲノム育種研究ユニット
* [http://www.nias.affrc.go.jp/soybean/soybean_genome_research_team/xing_zhi_zhuan_huan.html ダイズ形質転換プロトコール]

===除草剤耐性ダイズの衝撃===

遺伝子組換え作物といえばダイズが思い浮かぶほど、遺伝子組換え技術はダイズ生産に大きなインパクトを与えました。アメリカ合衆国における組換えダイズの栽培面積は、2006年には全ダイズ作付面積の89 %に達しています。また、ブラジルやアルゼンチン、中国などでも遺伝子組換えダイズの商業生産が開始され、組換えダイズの全世界での栽培面積は2006年には5,860万 ha に達しています (参考までに、日本の耕地面積は約500万 ha です) 。栽培されている遺伝子組換え体は、除草剤の一種であるグリホサートに対して耐性を示す除草剤耐性品種です。農業生産では農作物の周辺にはびこる雑草の生育を抑え、雑草との競合から作物を守り、太陽光を占有できるように育てる必要があります。とくに、夏作物であるダイズは雑草との競合が激しく、雑草の防除を怠ると、ダイズの収量は激減します。雑草を防除するためにさまざまな除草剤が実用化され、農家は作物や雑草の種類、栽培条件に応じて除草剤を選択し、使用しています。しかし、ダイズ自体も植物であることから、ダイズに障害を及ぼすことなく、その他全ての雑草に有効な除草剤は存在しません。ダイズ自体にはできるだけ薬害を示さない除草剤を適切な時期に散布するとともに、畑を何度か耕し、雑草の生育を抑え、ダイズを素早く十分に生育させます。しかし、大規模圃場では、耕起により肥沃な表土が流出する問題が深刻化しています。そのため、アメリカやブラジルでは土を耕さない、不耕起栽培が普及しています。不耕起栽培では、表土の流出を食い止めることができるのですが、土を耕さないため、雑草の生育が旺盛になります。そこで、除草剤耐性品種を栽培し、グリホサートを施用することにより効率的に不耕起栽培を行えるようになりました。

それでは、この遺伝子組換えダイズはどのような機構で、除草剤に対して耐性になっているのでしょうか。グリホサートは、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンの芳香族アミノ酸の生合成経路の初期過程に位置するシキミ酸経路中の 5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素 (EPSPS) を標的酵素として特異的に結合し、その活性を阻害します。そこで、EPSPSと同様の働きをするものの、グリホサートの影響を受けないEPSPS酵素が探索され、土壌細菌であるアグロバクテリウムからCP4 EPSPSタンパク質が見つけられました。そして、このタンパク質の遺伝子を遺伝子銃法によってダイズへ導入することにより、除草剤耐性ダイズが作られました。グリホサートをまくと、雑草は枯れてしまいますが、CP4 EPSPSを持っているダイズは影響を受けずに生育します。われわれ人間を含む動物や昆虫は、もともとEPSPSを持っていないので、グリホサートには影響されず、毒性も示しません。また、グリホサートは土壌中で微生物によって水と炭酸ガスに分解、不活性化されるため、残留性も低くなっています。除草剤耐性品種を栽培した場合は、除草剤の散布回数を減らせるうえ、土壌の浸食を抑え、動物や昆虫に対する直接的な影響もありません。

このように遺伝子組換え技術は、農業生産そのものを変革する大きな影響力を示しました。

===遺伝子導入技術の開発===

遺伝子組換え技術は導入遺伝子によって目的とする形質 (遺伝的な性質のことを形質と呼びます) だけを改変することや、除草剤耐性のように交配では不可能な異種生物由来の遺伝子によって新規な形質を付与することを可能にしました。さらに、遺伝子組換え技術は、ゲノム研究や分子生物学研究などにおいて遺伝子の機能解析に利用される基盤的な技術です。遺伝子の機能を調べるためには、特定の遺伝子を過剰に発現させたり、RNAi (RNA干渉) 技術などによって発現を抑制させる技術がしばしば用いられます。そのため、イネやトウモロコシなど多くの作物では安定的な遺伝子組換え技術が開発されています。遺伝子組換えダイズがその利用の是非を含め、あまりにも有名になったため、ダイズにおいても簡単に遺伝子組換えを行うことができると考えられがちです。しかし、イネやタバコのよう組換え体を容易に作出することはできません。ここでは、私たちの研究室で実施している形質転換技術を紹介します。

==培地の調整==

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==遺伝子銃法==

===遺伝子銃法による形質転換の手順===

# ダイズ (品種：Jack) を温室で栽培する
# 長径が-5 mm程度に達した未熟子葉を不定胚誘導培地に置床し、不定胚を誘導する (図1AとB) 
# 不定胚を不定胚増殖培地へ移し、維持・増殖する (図1C) 
# 増殖した不定胚を遺伝子導入培地に集め、表面を乾燥する
# 目的遺伝子をパーティクルガン (日本バイオ・ラッド社製、PDS-1000/He) で不定胚へ導入する
# ハイグロマシンを15-45 mg/lの濃度で含んだ選抜培地で形質転換した不定胚を選抜する (図1D) 
# ハイグロマシン存在下で緑色を示す不定胚をFNL0S3S3液体培地で成熟させる (図1E) 
# 成熟した胚をシャーレで乾燥する (図1F) 
# 発芽培地で発芽させる (図1G) 
# 正常に発芽した胚を発根培地へ移し、十分に生長させる
# 順化後、温室に移植する (図1HとI) 

; 図1 不定胚の誘導と遺伝子銃による遺伝子組換え体の作出

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===不定胚の誘導===

高等植物では、体細胞から種子胚の発生と類似の形態変化を経て植物体が発生する不定胚 (体細胞胚) 形成という現象が知られています。ダイズの場合、未熟子葉 (図1A) を高濃度の 2,4-D を含む培地で培養すると不定胚が形成されます。不定胚の誘導能や増殖能は品種の遺伝子型に依存し、なかでも、アメリカ品種「Jack」や「Fayette」では、遺伝子導入に適した、小型で再分化能を保持した不定胚を容易に増殖することができます。一方、多くの日本品種では不定胚を得ることが困難で、たとえ不定胚を得ることができても、再分化能を有する不定胚を維持、増殖することができません。

アメリカ品種「Jack」を温度制御の可能な温室内で、昼温 28℃、夜温 22℃程度、自然日長下で栽培します。播種後 2ヶ月程度で花が咲き、開花後、莢が伸びてきます。その莢の中で発達中の種子の長径が 3-5 mmになった段階で、種皮と胚軸を取り除き、未熟子葉の向軸側 (平らな面) を上にして不定胚誘導培地 (MSD40) で培養します (図1A) 。温度 25℃、日長 23時間、光強度 5-10 μEm<sup>-2</sup>s<sup>-1</sup>で 3-4 週間程度培養すると、子葉の表面に不定胚が誘導されます (図1B) 。誘導された不定胚を不定胚増殖培地(FN Lite 25 ml/ 100 ml 三角フラスコ)に移し、回転数 95-110 rpm/分で振とう培養することにより、次々と不定胚 (二次胚) を発生し、増殖、維持することができます (図1C) 。不定胚は1週間毎に新しい不定胚増殖培地に継代培養し、不定胚の量が増えると何本かのフラスコに取り分けます。不定胚は再分化能を保ったまま、数ヶ月間の継続培養が可能です。

===遺伝子銃による遺伝子の導入===

プラスチック製のプレート (Φ90×20 mm) に分注・固化した遺伝子導入培地(MSD20)の中央、直径約25 mmに不定胚 (約0.8 g) をまんべんなく広げ、表面を乾燥させます。Plasmid Midi Kit (キアゲン) で導入遺伝子を含むプラスミドを調整し、1 μg/μlの濃度になるよう滅菌水に溶かします。遺伝子銃 (日本バイオ・ラッド、PDS-1000/He) による遺伝子の導入は、機器に添付のプロトコールに従っています。すなわち、3 mgの金粒子 (マイクロキャリア) と5 μgのプラスミドDNAをよく混合し、塩化カルシウム/スペルミジン法で金粒子表面にDNAを塗布します。3 mgの金粒子で6枚のマクロキャリアを調整、すなわち6回の撃ち込みを行うことができます。遺伝子銃による撃ち込み条件を最適化するため、不定胚での緑色蛍光タンパク質sGFP(S65T)の一過的発現と遺伝子銃に使用する金粒子の大きさ、撃ち込み圧力および撃ち込み距離との関係を調査しました。その結果、0.6μmの金粒子を使用し、7.6 MPa (1,100 psi)の圧力で、6 cmの距離で撃ち込んだ場合に最も良好な結果を示しました。現在は、これらの条件を組換え体の作出に使用しています。また、金粒子の分布を均一にするため、プレートの向きを換え、2回撃ち込みます。

===遺伝子組換え体の選抜===

遺伝子を導入した不定胚は不定胚増殖培地で 1週間培養した後、15 mg/Lの濃度でハイグロマイシンを添加した選抜培地で1週間、30 mg/Lの濃度でハイグロマイシンを添加した選抜培地で4週間、さらに、45 mg/Lの濃度でハイグロマイシンを含む選抜培地で1週間培養します。この間、培地は毎週交換します。ハイグロマイシン添加培地で6週間培養すると、ほとんどの不定胚は白化してしまいます。そのため、緑色を維持している遺伝子組換え体を容易に識別することができます (図1D) 。

===植物体の再分化===

ハイグロマイシンに耐性を示した緑色の不定胚塊は、15 mg/ Lハイグロマイシンを添加した選抜培地で十分に増殖させます。そして、不定胚の一部 (約 20 mg) を不定胚成熟培地 (FNL0S3S3 25 ml / 100 ml 三角フラスコ) に移し、3-5週間振とう培養すると、子葉状の胚が発達します (図1E) 。この間、培地は交換しません。成熟した胚は、過度の乾燥を防ぐため約1cm<sup>3</sup>の発芽培地 (MS0) 片の入ったシャーレで3-7日間乾燥させます (図1F) 。乾燥によって胚は淡い黄色に変化し、この胚を発芽培地で発芽させます (図1G) 。発芽した個体は発根培地 (0.5×B5) で十分に生長させ、順化させた後に培養土を充填したポットに移植し、閉鎖系温室内で栽培します (図1HとI) 。

以上の方法により、不定胚の誘導から約6ヶ月間で遺伝子組換え体を作出することができます。

;農業生物資源研究所　ダイズゲノム育種研究ユニットの発表文献

# Y. Kita, N. Nishizawa, M. Takahashi, M. Kitayama, M. Ishimoto. (2007) Genetic improvement of the somatic embryogenesis and regeneration in soybean and transformation of the improved breeding lines. Plant Cell Reports 26:439-447
# K. Nishizawa, Y. Kita, M. Kitayama, M. Ishimoto. (2006) A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean. Plant Cell Reports 25:1355-1361
# M. M. Khalafalla, R. S. Mizanur, Y. Nakamoto, K. Wakasa, M. Ishimoto. (2005) Optimization of particle bombardment conditions by monitoring of transient sGFP(S65T) expression in transformed soybean. Breed. Sci. 55:257-263
# H.A. El-Shemy, M. Teraishi, M.M. Khalafalla, T. Katsube-Tanaka, S. Utsumi, M. Ishimoto. (2004) Isolation of soybean plants with stable transgene expression by visual selection based on green fluorescent protein. Mol. Breed. 14:227-238 
# 石本政男, M.S. Hanafy (2005)　ダイズにおける遺伝子組換え技術とその利用 　日本土壌肥料学会編　博友社刊「ダイズの生産・品質向上と栄養生理」p129-156
# 石本政男 (2003) ダイズにおける遺伝子組換え技術の確立とその利用　農業および園芸 78(9):8-13

;参考文献

# M.A. Schmidt, D.M. Tucker, E.B. Cahoon, W.A. Parrott. (2005)Towards normalization of soybean somatic embryo maturation. Plant Cell Rep. 24:383-391
# E.S. Tomlin, S.R.Branch, D.Chamberlain, H.Gabe, M.S.Wright, C.N.Stewart Jr. (2002) Screening of soybean, Glycine max (L.) Merrill, lines for somatic embryo induction and maturation capability from immature cotyledons. In Vitro Cell. Dev. Biol. 38:543-548
# V.M. Samoylov, D.M. Tucker, W.A. Parrott. (1998) A liquid medium-based protocol for rapid regeneration from embryogenic soybean cultures. Plant Cell Rep. 18:49-54
# J.J. Finer, P.Vain, M.Jones, M.McMullen. (1992) Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells. Plant Cell Rep. 11:323-328
# J.J. Finer, M.D.Mcmullen. (1991) Transformation of soybean via particle bombardment of embryogenic suspension culture tissue. In Vitro Cell. Dev. Biol. 27:175-182
# D. McCabe, W.F.Swain, B.J.Martinell, P.Christou. (1988) Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration. Biotechnology 6:923-926.
# J.J. Finer, A.Nagasawa. (1988) Development of an embryogenic suspension culture of soybean [Glycine max (L.) Merrill]. Plant Cell Tissue Organ Cult. 15:125-136
# O. Gamborg, R.Miller, K.Ojima. (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cell. Exp. Cell Res. 50:151-158
# T. Murashige, F. Skoog. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant 15:473-497.


==アグロバクテリウム法==

===アグロバクテリウム法による形質転換の手順===

# ダイズ種子を塩素ガス法で滅菌する
# 発芽培地で発芽させる (5日間) 
# アグロバクテリウムをYEP培地で増殖させ、遠心後、共存液体培地に再懸濁する
# 発芽した種子から子葉を切り出し、子葉節にメスで傷付け、懸濁したアグロバクリウム菌体液に30分間浸漬する
# 共存培地 (固形) に滅菌したろ紙を敷き、子葉節を下向きにして子葉を置き、25℃、暗黒下で5日間共存培養する (図2A) 
# 過剰なアグロバクテリウムを取り除いた子葉を不定芽誘導培地に置き、25℃、18時間日長で不定芽を誘導する
# ハイグロマシンを5 mg/lの濃度で含んだ不定芽選抜培地で形質転換した不定芽を選抜する (図2C) 
# ハイグロマシンを10 mg/lの濃度で含んだ不定芽伸長培地で形質転換した不定芽を伸長させる
# 3cm以上に伸長した芽を発根培地へ移し、十分に生長させる (図2D) 
# 順化後、温室に移植する

; 図2 子葉節へのアグロバクテリウムの感染と組換え体の作出

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===不定芽誘導の品種間差===

アグロバクテリウム法ではアグロバクテリウム (Agrobacterium tumefaciens) を分裂細胞あるいは再分化能を有する細胞に感染させます。アグロバクテリウムに感染させる組織として、不定胚、茎頂や子葉節が報告されています。しかし、不定胚を用いる場合は、遺伝子銃法の場合と同様に誘導と維持に時間と手間を要します。また、茎頂の成功例は数例しかありません。そこで、これまでに多数の報告がある子葉節を用いることにしました。ただし、不定芽の誘導能には品種間差が存在することが知られています。まず、日本品種を中心にアメリカで遺伝子組換えに用いられている品種と不定芽の誘導能を比較しました。アメリカ品種の「Bert」と「Throne」では約60 %以上の子葉節から不定芽が誘導されました。また、日本品種「ミスズダイズ」においても50 %以上の子葉節から不定芽が誘導されました。そこで、これら3品種を用いて、アグロバクテリウム法による形質転換を実施しています。

===アグロバクテリウムとの共存培養===

緑色蛍光タンパク質sGFP (S65T) の遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子 (hpt) を接続したコンストラクト (pPZP200ベースのバイナリーベクター) を作製しました。アグロバクテリウム系統EHA105へエレクトロポーレーション法によって導入し、バイナリベクターが導入されたコロニーを100 mg/Lスペクチノマイシンと50 mg/Lハイグロマイシンを含むLB固形培地上で選抜します。アグロバクテリウム系統とバイナリベクターの組み合わせによって、適切な抗生物質の種類と濃度を選択する必要があります。
植物組織に感染させるために、バイナリベクターを導入したアグロバクテリウムを200 mlのYEP培地を入れた500 mlのフラスコで650 nmの吸光度が0.8-1.0に達するまで25℃で振とう培養します。植物組織に接種する前に50 mlの培養液を20 ℃、3,270 gで10分間遠心し、菌体を沈殿させ、この沈殿物に25 mlの液体の共存培地を加え、菌体を再懸濁させます。

ダイズの乾燥種子をデシケーターに入れ、塩素ガスで滅菌します。塩素ガスは、100mlの次亜塩素酸溶液 (約5%) に3.5mlの濃塩酸を加えて発生させます。16時間滅菌した種子を発芽培地上に置床し、温度25 ℃、日長18時間明期：6時間暗期、光強度90-150 mEm<sup>-2</sup>s<sup>-1</sup>の培養器で5日間発芽させます。子葉の表面が緑色になり種皮が剥がれた状態の芽生えから、根と大部分の胚軸を取り除き、滅菌した外科用メスで胚軸を切断し、2枚の子葉を切り離します。それぞれの子葉から上胚軸を取り除き、葉腋から子葉節にかけて移動しながら10回傷を付けます。25 mlの再懸濁したアグロバクテリウムの菌体液に約50枚の子葉を30分間浸漬します。固形の共存培地を含むプラスチックプレート  (Φ90×20 mm) に滅菌したろ紙を敷き、プレート当たり子葉5枚を向軸側 (平らな面) を下にして25℃、暗黒下で5日間共存培養します (図2A) 。この段階で、アグロバクテリウムの感染による導入遺伝子の発現 [この場合は緑色蛍光タンパク質sGFP (S65T) ] が観察できます (図2B) 。

===不定芽の選抜===

不定芽の誘導、選抜といった一連の培養には、発芽に用いた培養器を同じ条件、温度25℃、日長18時間明期：6時間暗期、光強度90-150 μEm<sup>-2</sup>s<sup>-1</sup>で使用します。共存培養終了後、過剰に繁殖したアグロバクテリウムを液体の不定芽誘導培地で洗浄し、固形の不定芽誘導培地を含むプラスチックプレート (Φ90×20 mm) に置床します。選抜用のハイグロマイシンを含まない不定芽誘導培地で2週間培養した後、誘導された不定芽を含む組織を5 mg/Lのハイグロマイシンを含む新鮮な不定芽選抜培地へ2週間毎に移します。不定芽選抜培地で4週間培養した後、子葉や胚軸などを取り除き、10 mg/Lのハイグロマイシンを含む不定芽伸長培地へ移します (図2C) 。健全な不定芽を含む組織は、ハイグロマイシンを含む新鮮な不定芽伸長培地に2週間毎に移します。3 cm以上に伸長した芽は切り取って、発根培地に植えます。そこで発根した個体を十分に生長させ、順化させた後に培養土を充填したポットへ移植し、閉鎖系温室内で栽培します (図2D)。

;参考文献

# M.M. Paz, J.C. Martinez, A.B. Kalvig, T.M. Fonger, K. Wang. (2006) Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation. Plant Cell Rep. 25:206-213
# P.M. Olhoft, L.E. Flagel, D.A. Somers. (2004) T-DNA locus structure in a large population of soybean plants transformed using the Agrobacterium-mediated cotyledonary-node method. Plant Biotechnol. J. 2:289-300
# P. Zeng, D.A. Vadnais, Z. Zhang, J.C. Polacco. (2004) Refined glufosinate selection in Agrobacterium-mediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merrill]. Plant Cell Rep. 22:478-482
# M.M. Paz, H. Shou, Z. Guo, Z. Zhang, A.K. Banerjee, K. Wang. (2004) Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant. Euphytica 136:167-179
# P.M. Olhoft, L.E. Flagel, C.M. Donovan, D.A. Somers. (2003) Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method. Planta 216:723-735
# P.M. Olhoft, D.A. Somers. (2001) L-Cysteine increases Agrobacterium-mediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-node cells. Plant Cell Rep. 20:706-711
# P.M. Olhoft, K. Lin, J. Galbraith, N.C. Nielsen, D.A. Somers. (2001) The role of thiol compounds in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells. Plant Cell Rep. 20:731-737
# Z. Zhang, A.Xing, P.Staswick, T.E.Clemente. (1999)The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean. Plant Cell Tissue Organ Cult. 56:37-46