PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum
From Metabolomics.JP
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(→選抜) |
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* 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。 | * 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。 | ||
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; 選抜3回目（再分化誘導） | ; 選抜3回目（再分化誘導） | ||
: 再分化誘導培地 MS+1mg/lZeatin+抗生物質+250mg/lCb+3%Suc+0.8%Agar | : 再分化誘導培地 MS+1mg/lZeatin+抗生物質+250mg/lCb+3%Suc+0.8%Agar | ||
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* 1シャーレあたり 20切片以下。 | * 1シャーレあたり 20切片以下。 | ||
* 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。 | * 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。 | ||
| + | |- | ||
| + | |[[Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_111.jpg|200px]] | ||
| + | | | ||
| + | ; 選抜4回目（シュート伸長・発根） | ||
| + | : シュート伸長・発根誘導培地：MS+1mg/lIBA+抗生物質+125mg/lCb+3% Suc+0.8%Agar | ||
| + | : カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す | ||
| + | : | ||
| + | |- | ||
| + | |[[Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_112.jpg|200px]] | ||
| + | | | ||
| + | ; 選抜5回目（発根） | ||
| + | : 発根誘導培地：MS+0.5mg/lIBA+抗生物質+125mg/lCb+3% Suc+0.8%Agar | ||
| + | ; point | ||
| + | * シュートの条件：発根したカルスから取る。大きさ（ 2cm程度。 | ||
| + | * 発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除く。 | ||
| + | * アグロとエスケープを防ぐため、少なくとも3回は頂芽を植継ぐ。 | ||
| + | * 花芽は切り落とす！ | ||
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Revision as of 17:57, 4 July 2011
Contents |
トマト遺伝子導入実験プロトコール
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2005.6/27改正版 |
形質転換スケジュール
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実験プロトコール
滅菌
- トマト遺伝子導入実験プロトコール img 031.jpg
700mg/300粒
- トマト遺伝子導入実験プロトコール img 032.jpg
70%EtOH 2分振とう
- トマト遺伝子導入実験プロトコール img 033.jpg
- トマト遺伝子導入実験プロトコール img 034.jpg
1%次亜塩+200μl/L tween 10分振とう
洗浄
クリーンベンチ作業
- トマト遺伝子導入実験プロトコール img 041.jpg
洗浄前
- トマト遺伝子導入実験プロトコール img 042.jpg
SDWで1分間×5回洗浄
- トマト遺伝子導入実験プロトコール img 043.jpg
洗浄後
- point
- 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。
播種
クリーンベンチ作業
- トマト遺伝子導入実験プロトコール img 051.jpg
1/2MS+3%Suc+0.8%Agar pH5.8 25℃,16h日長で培養]
- トマト遺伝子導入実験プロトコール img 052.jpg
50-60粒/7cm
マヨネーズ瓶 - トマト遺伝子導入実験プロトコール img 053.jpg
50粒播種するとこんな感じ
→約1週間培養
前培養
クリーンベンチ作業
File:トマト遺伝子導入実験プロトコール img 061.jpg 作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように 胚軸は下の方を使う 子葉の両端を切る |
→湿らしたろ紙へ一時置き→ | File:トマト遺伝子導入実験プロトコール img 062.jpg MS+2mg/l Zeatin+3%Suc+0.8%Agar 48切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ） パラフィルムでシール →2日間,25℃,16h日長で培養 |
- point
- 本葉が出たものはNG。
- 作業中乾かないように注意！
- 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。
アグロバクテリウムの調整
- 前培養；
- LBプレート（+抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
- ↓2日間 28℃,暗所
- 感染用培養；
- シングルコロニーをLBプレート（+抗生物質）にストリーク
- ↓2日間 28℃,暗所
- point
- 必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する。
- 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。
感染
- 注）改善の余地あり
- トマト遺伝子導入実験プロトコール img 081.jpg
菌液の準備；
MS液体培地50ml+アセトシリンゴン(10mg/L) スパールで集菌し、ピペッティング - トマト遺伝子導入実験プロトコール img 082.jpg
切片を滅菌した茶漉しに入れ
菌液内で1分間攪拌 - トマト遺伝子導入実験プロトコール img 083.jpg
滅菌したキムタオルで
水分除去 - トマト遺伝子導入実験プロトコール img 084.jpg
さらに水分除去
- トマト遺伝子導入実験プロトコール img 085.jpg
元の培地に
（3日間,21℃,遮光）
除菌
- 注）改善の余地あり
- 洗浄：MS液体培地
- 除菌：MS液体培地+Cb500mg/l
- トマト遺伝子導入実験プロトコール img 091.jpg
2,3分ゆすりながら洗う
洗浄1回/除菌1回 - トマト遺伝子導入実験プロトコール img 092.jpg
水分除去→選抜へ
(2週間,25℃,16h日)
- point
- 傷をつけないように気をつける。
選抜
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