PlantBiotech:Species/Solanum lycopersicum

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==トマト遺伝子導入実験プロトコール==
 
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2005.6/27改正版
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==形質転換スケジュール==
 
==形質転換スケジュール==
 
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;　月曜日
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:　シングルコロニーの培養
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:　感染用アグロの培養
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==実験プロトコール==
 
==実験プロトコール==
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Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_031.jpg|700mg/300粒
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===洗浄===
 
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Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_041.jpg|洗浄前
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Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_042.jpg|SDWで1分間×5回洗浄
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* 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。
 
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===播種===
 
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Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_051.jpg|1/2MS+3%Suc+0.8%Agar pH5.8 25℃,16h日長で培養]
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Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_052.jpg|50-60粒/7cm<br>マヨネーズ瓶
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-011.png|50-60 粒/7 cm <br>マヨネーズ瓶
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Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_053.jpg|50粒播種するとこんな感じ<br>→約1週間培養
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-012.png|50 粒播種するとこんな感じ<br>→約 1 週間培養
 
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===前培養===
 
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|→湿らしたろ紙へ一時置き→
 
|→湿らしたろ紙へ一時置き→
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|[[Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_062.jpg|200px|thumb|MS+2mg/l Zeatin+3%Suc+0.8%Agar<br>48切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ）<br>パラフィルムでシール<br>→2日間,25℃,16h日長で培養]]
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|[[Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|200px|thumb|MS+ 2 mg/l Zeatin+ 3 % Suc+0.8 % Agar<br>48 切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ）<br>パラフィルムでシール<br>→ 2 日間, 25 ℃, 16 h 日長で培養]]
 
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* 本葉が出たものはNG。
 
* 本葉が出たものはNG。
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* 作業中乾かないように注意！
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* 作業中乾かないように注意!!
 
* 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。
 
* 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。
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===アグロバクテリウムの調整===
 
===アグロバクテリウムの調整===
 
;　前培養；
 
;　前培養；
 
:　LBプレート（+抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
 
:　LBプレート（+抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
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:　↓2日間 28℃,暗所
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:　↓2 日間 28 ℃,暗所
 
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;　感染用培養；
 
;　感染用培養；
 
:　シングルコロニーをLBプレート（+抗生物質）にストリーク
 
:　シングルコロニーをLBプレート（+抗生物質）にストリーク
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:　↓2日間 28℃,暗所
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* 必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する。
 
* 必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する。
 
* 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。
 
* 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。
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===感染===
 
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Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_081.jpg|菌液の準備；<br>MS液体培地50ml+アセトシリンゴン(10mg/L) スパールで集菌し、ピペッティング
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-015.png|菌液の準備；<br>MS液体培地 50 ml +アセトシリンゴン(10 mg/L) スパールで集菌し、ピペッティング
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Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_082.jpg|切片を滅菌した茶漉しに入れ<br>菌液内で1分間攪拌
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|切片を滅菌した茶漉しに入れ<br>菌液内で 1 分間攪拌
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Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_083.jpg|滅菌したキムタオルで<br>水分除去
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|滅菌したキムタオルで<br>水分除去
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Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_084.jpg|さらに水分除去
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-018.png|さらに水分除去
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Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_085.jpg|元の培地に<br>（3日間,21℃,遮光）
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png|元の培地に<br>（3 日間, 21 ℃,遮光）
 
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===除菌===
 
===除菌===
 
;注）改善の余地あり
 
;注）改善の余地あり
 
:　洗浄：MS液体培地
 
:　洗浄：MS液体培地
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:　除菌：MS液体培地+Cb500mg/l
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Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_091.jpg|2,3分ゆすりながら洗う<br>洗浄1回/除菌1回
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-016.png|2,3 分ゆすりながら洗う<br>洗浄 1 回/除菌 1 回
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Image:トマト遺伝子導入実験プロトコール_img_092.jpg|水分除去→選抜へ<br>(2週間,25℃,16h日)
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Image:Horticulture-Solanum-lycopersicum-017.png|水分除去→選抜へ<br>(2 週間, 25 ℃, 16 h 日長)
 
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* 傷をつけないように気をつける。
 
* 傷をつけないように気をつける。
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===選抜===
 
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; 選抜1,2回目（カルス誘導）
 
; 選抜1,2回目（カルス誘導）
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: カルス誘導培地：MS+2mg/lZeatin+抗生物質+250mg/lCb+3%Suc+0.8%Agar
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* サージカルテープでシール（選抜 1）。
 
* サージカルテープでシール（選抜 1）。
 
* パラフィルムでシール（選抜 2）。
 
* パラフィルムでシール（選抜 2）。
 
* 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。
 
* 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。
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; 選抜3回目（再分化誘導）
 
; 選抜3回目（再分化誘導）
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: 再分化誘導培地 MS+1mg/lZeatin+抗生物質+250mg/lCb+3%Suc+0.8% Agar
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: 再分化誘導培地 MS+ 1 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+ 0.8 % Agar
 
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* パラフィルムでシール。
 
* パラフィルムでシール。
 
* 1シャーレあたり 20切片以下。
 
* 1シャーレあたり 20切片以下。
 
* 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。
 
* 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。
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: シュート伸長・発根誘導培地：MS+ 1 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
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: カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
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; 選抜5回目（発根）
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* シュートの条件：発根したカルスから取る。大きさ（ 2cm程度。
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* 発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除く。
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* アグロとエスケープを防ぐため、少なくとも3回は頂芽を植継ぐ。
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* 花芽は切り落とす!!
 
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* 根を傷つけない
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* ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1 週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
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* 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
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* 水やりは最初の 2 週間は水のみ、その後 1000 倍ハイポネックッス/週 1。
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===効率===
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; 植物形質転換用バイナリーベクター
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: Liu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 96: 6535-6540
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; (平均インサート長：80 Kb)
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: 1ベクターあたり
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: 　感染：240 切片
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: 　馴化できた系統数： 0-21 系統作出
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; point
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* カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります!!
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: Yoichi Ogawa, Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol; 181: 331-336
 +
: Screening for highly active β-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens

Latest revision as of 16:04, 1 September 2011

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Contents

[edit] トマト遺伝子導入実験プロトコール

Horticulture-Solanum-lycopersicum-001.png

2005. 6/27 改正版

[edit] 形質転換スケジュール

Horticulture-Solanum-lycopersicum-002.png

[edit] 実験プロトコール

[edit] 滅菌

  • 700 mg/300 粒

  • 70 % EtOH 2 分振とう

  • Horticulture-Solanum-lycopersicum-005.png

  • 1 % 次亜塩+ 200 μl/L tween 10 分振とう

[edit] 洗浄

クリーンベンチ作業

  • 洗浄前

  • SDWで 1 分間× 5 回洗浄

  • 洗浄後

point
  • 種子の沈殿が洗浄の目安。洗浄が甘いと発芽が悪くなる。

[edit] 播種

クリーンベンチ作業

  • 1/2 MS+3 % Suc+ 0.8 % Agar pH 5.8 25 ℃, 16 h 日長で培養

  • 50-60 粒/7 cm
    マヨネーズ瓶

  • 50 粒播種するとこんな感じ
    →約 1 週間培養

[edit] 前培養

クリーンベンチ作業

作業は湿らせたろ紙の上で子葉を傷つけないように
胚軸は下の方を使う
子葉の両端を切る
 →湿らしたろ紙へ一時置き→
MS+ 2 mg/l Zeatin+ 3 % Suc+0.8 % Agar
48 切片/1シャーレ(9cm深底シャーレ）
パラフィルムでシール
→ 2 日間, 25 ℃, 16 h 日長で培養
point
  • 本葉が出たものはNG。
  • 作業中乾かないように注意!!
  • 子葉は必ず背軸面が培地に触れるように置床。

[edit] アグロバクテリウムの調整

　前培養；
　LBプレート（+抗生物質）にグリセロールストックのアグロバクテリウムをストリーク
　↓2 日間 28 ℃,暗所
　
　感染用培養；
　シングルコロニーをLBプレート（+抗生物質）にストリーク
　↓2 日間 28 ℃,暗所
　
point
  • 必ず増殖中（盛り上がる前）の菌プレートを用意する。
  • 導入した遺伝子によって増殖速度が微妙に異なるため、培養時間をずらしたプレートを何枚か準備と良い。

[edit] 感染

注）改善の余地あり

  • 菌液の準備；
    MS液体培地 50 ml +アセトシリンゴン(10 mg/L) スパールで集菌し、ピペッティング

  • 切片を滅菌した茶漉しに入れ
    菌液内で 1 分間攪拌

  • 滅菌したキムタオルで
    水分除去

  • さらに水分除去

  • 元の培地に
    （3 日間, 21 ℃,遮光）

[edit] 除菌

注）改善の余地あり
　洗浄：MS液体培地
　除菌：MS液体培地+Cb 500 mg/l

  • 2,3 分ゆすりながら洗う
    洗浄 1 回/除菌 1 回

  • 水分除去→選抜へ
    (2 週間, 25 ℃, 16 h 日長)

point
  • 傷をつけないように気をつける。

[edit] 選抜

Horticulture-Solanum-lycopersicum-014.png
選抜1,2回目（カルス誘導）
カルス誘導培地：MS+ 2 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+0.8 % Agar
point
  • サージカルテープでシール（選抜 1）。
  • パラフィルムでシール（選抜 2）。
  • 24切片/1シャーレ子葉は表面を上に、少し培地に埋め込む。
選抜3回目（再分化誘導）
再分化誘導培地 MS+ 1 mg/l Zeatin+抗生物質+ 250 mg/l Cb+ 3 % Suc+ 0.8 % Agar
point
  • パラフィルムでシール。
  • 1シャーレあたり 20切片以下。
  • 3回目の選抜ではカルスの反対側の切片を切り落とす。
Horticulture-Solanum-lycopersicum-019.png 　
選抜4回目（シュート伸長・発根）
シュート伸長・発根誘導培地：MS+ 1 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
カルス化した切片をマヨネーズ瓶に移す
　
Horticulture-Solanum-lycopersicum-020.png 　
選抜5回目（発根）
発根誘導培地：MS+ 0.5 mg /lIBA+抗生物質+ 125 mg/lCb+ 3% Suc+ 0.8 % Agar
point
  • シュートの条件：発根したカルスから取る。大きさ（ 2cm程度。
  • 発根を阻害されるのでカルスはきれいに取り除く。
  • アグロとエスケープを防ぐため、少なくとも3回は頂芽を植継ぐ。
  • 花芽は切り落とす!!

[edit] 馴化

Horticulture-Solanum-lycopersicum-020.png
→
Horticulture-Solanum-lycopersicum-021.png
point
  • 根を傷つけない
  • ロックウールに馴化した苗を容器に入れサランラップで覆い、 1 週間程度かけてサランラップをあけて湿度を下げていく。
  • 土でも馴化できるが、湿度には十分注意する。
  • 水やりは最初の 2 週間は水のみ、その後 1000 倍ハイポネックッス/週 1。

[edit] 効率

植物形質転換用バイナリーベクター
Liu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 96: 6535-6540
Horticulture-Solanum-lycopersicum-022.png
(平均インサート長：80 Kb)
1ベクターあたり
　感染：240 切片
　馴化できた系統数： 0-21 系統作出
point
  • カルベニシリンよりMeropenemの方がアグロバクテリウムの増殖を抑えるとの報告もあります!!
Yoichi Ogawa, Masahiro Mii (2004) Arch Microbiol; 181: 331-336
Screening for highly active β-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens
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