PlantBiotech:Species/Lotus japonicus

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ミヤコグサ形質転換マニュアル


モデル植物としてのミヤコグサLotus japonicus は、マメ科植物における数少ないstableな形質転換系を提供するものです。Agrobacteriumを用いた基本的な形質転換法は 1992 年デンマークAarhus大学のグループによって確立されましたが[1]、その後、当時この研究室のメンバーであったJiri Stillerらによって改訂されたプロトコルが提案され[2]、またAarhusのグループも改訂された方法を発表しており[3]、現在多くの研究室がこれらのプロトコルによって実験を行っています。

以下のミヤコグサ形質転換マニュアルは、Aarhus大学の研究室の最近のプロトコルと、その後のJiri Stillerらによる改訂プロトコルをもとにし、それぞれのグループから入手したいくつかの最近のノウハウを付け加えて、現在私たちの研究室で行っている方法を整理したものです。大筋はJiri Stillerらによる改良法に準拠しています。 ミヤコグサ形質転換はその効率、安定性、必要時間などの点からみて、たとえばアラビドプシスやイネ等に匹敵するほどに容易であるとはいえません。特に再生効率や、方法の安定性 (再現性) 、再生個体を得るまでの時間等の面で、今後さらに改良が必要だと思います。また、比較的高頻度に培養変異が起こると思われることから、in-planta法の確立を含めて今後検討が行われるべきでしょう。

In vitroの培養を含む形質転換法は、材料となる植物の培養条件や、グロースキャビネットその他の様々な条件のわずかな違いによって微調整が必要で、それぞれの研究室で実際の条件に応じた最適化の工夫が必要だと思われます。しかし、以下のプロトコルが、これから形質転換実験を始めようとする方に、一応のスタンダードを提供するものとなれば幸いです。疑問点、質問など、またどんな細かい点でも、このプロトコルの改良のための示唆を期待し歓迎します。

この方法は、主としてAhGifuAhを材料として最適化したものです。MG-20についても、BAP濃度の変更を要しますが、一応は適用できます。しかしいまのところ、MG-20では不稔などの培養変異に基づくと思われる異常の頻度が高いために、よい結果が得られていません。

なお、ミヤコグサの種子滅菌法や栽培法、培地組成、交配法等に関して、今泉温子氏による「ミヤコグサの基本実験系マニュアル」が公開されていますので、併せて参考にしていただければと思います。

連絡先：河内 宏 <kouchih@abr.affrc.go.jp >
農業生物資源研究所 生理機能部 窒素固定研究室
参考文献
  1. ↑ Handberg, K. and Stougaard, J. (1992) Plant Jour.; 2(4): 487-496
  2. ↑ Jiri Stiller et al. (1997) Jour. Exp. Bot.; 48(312): 1357-1365
  3. ↑ Thykjaer, T. et al. (1998) In AgCell Biology: A laboratory handbook, 2nd Ed.Ah: 518-525, Academic Press

試薬の調整

試薬名 調製法 濃度
B5 Vitamin B5 Vitamin Stock (Sigma: #G1019) 1000x 滅菌済みだが、0.22μm メンブレンフィルターで濾過し、1mlずつ分注して-20℃に保存。 フィルター滅菌には、注射器とDISMIC (ADVANTEC, 0.22μm)などを用いる（作業はクリーンベンチ内）。以下同様。 1000x
1M MES MES 21.3g を約80mlの滅菌水に溶かす。1M NaOHでpH 5.2とし、100mlに定容する。フィルター滅菌し、1.5mlずつに分注して-20℃に保存。 pH 5.2
BAP BAP (Sigma: #B-9395) 50mgを1mlの1M NaOHに溶かし、滅菌水で50mlとする。フィルター滅菌し、1mlずつに分注して-20℃に保存。または、BAP solution (Sigma: #B3274, 1mg/ml)をフィルター滅菌し、1mlずつに分注。 1 mg/ml
NAA NAA (Sigma; #N-0640) 50mg を24mlの95% EtOHに溶かし、滅菌水で50mlとする。またはNAA solution (Sigma: N1641, 1mg/ml)。フィルター滅菌し、1mlずつに分注して-20℃に保存。 1mg/ml
4M (NH4)22SO4 (NH4)22SO4 26.4g を50mlの滅菌水に溶かす。フィルター滅菌し、1.5mlずつに分注して-20℃に保存。
G418 Geneticine solution (Sigma #G-7014, 50mg/ml) フィルター滅菌し、1mlずつに分注して-20℃に保存。 50 mg/ml
Hygromycin B Hygromycin B (Sigma: #H-9773) 250mg を16mlの滅菌水に溶かす。(純度は通常70%くらい。ロットにより違う) フィルター滅菌し、1mlずつに分注して-20℃に保存。またはHygromycin B solution (Sigma: H5527, 50mg/ml)を用いる（純度は50%以上）。 10mg/ml
Cefotaxime Cefotaxime (Sigma: #C-7912) 3 g を100mlの滅菌水に溶かす。フィルター滅菌し、10mlずつ#2059に分注して-20℃に保存。 30 mg/ml
Acetosyringone Acetosyringone (Aldrich #D134406) をDMSOに20mg/mlになるように溶かす。フィルター滅菌し、1mlずつに分注して-20℃に保存。 20 mg/ml

培地の調整


形質転換の操作

種子の滅菌

  1. Lotus japonicus (Gifu) 種子 40 粒ずつを小型の磁製乳鉢に入れ、#400のサンドペーパーで擦って表面に傷を付ける[1]。または、種子を 2-3 ml の濃硫酸に漬け、 20 分間静置する[2]。
  2. 市販の次亜塩素酸ソーダの 1/2 希釈液に 0.02 % Tween20 を加え、種子をこの中に漬けて 10分 (硫酸処理後の場合は 20 分) インキュベートする。この間シーソーしんとう器などを用いて穏やかに攪拌する[3]。
  3. 滅菌水で 10 分ｘ 3 回洗う。
  4. 滅菌水で 20 分ｘ 3 回洗う[4]。

発芽

  1. 滅菌した濾紙(6 x 6 cm) を5mm程度の厚さにパイルし、90 x 20mm ペトリ皿におく。これに 20-25 ml の滅菌水を加え、この上に 滅菌種子 約80粒を播種する。
  2. パラフィルムでシールする。
  3. 暗黒下、 26 ℃で 4 日間培養し、その後 2 日間連続照明におく[5]。(MG-20の場合は暗黒下 3 日間、その後 2 日間連続照明)。

アグロ感染と共存培養 (co-cultivation)

  1. 感染の 2 日前からアグロバクテリウムをYEP寒天培地に植菌し、28 ℃で培養しておく。菌を掻き取り、4 ml のYMBにけんだくする[6]。
  2. 90 x 20 mm ペトリ皿に滅菌濾紙の5 mm パイルを入れ、20-25 ml のco-cultivation培地を加えておく。
  3. アグロけんだく液を 90 mm ペトリ皿中においた 2 枚の滅菌濾紙 (6 x 6 cm) に加える。
  4. 幼植物の胚軸(長さ 1-2 cm)を子葉の直下と根との境目で切り、アグロけんだく液で湿らせた濾紙の上に並べる (60-70 本) 。
  5. 10 本程度を束ねて、ピンセットで押さえ、メスで 3 mm 程度に細切する。すべて切り終わるまでアグロけんだく液に載せておく。
  6. 切片をco-cultivation培地を含む濾紙の上に並べる。ペトリ皿あたり 150-200 切片。
  7. パラフィルムでシール。
  8. 暗黒下、21 ℃で 6 日間共存培養する。

カルス誘導

  1. 共存培地から胚軸切片を載せたまま、一番上の濾紙だけをピンセットで取り上げ、90 x 20mm ペトリ皿中のカルス培地の上に置く (隙間に空気が入らぬように注意) 。
  2. 23 ℃、明(17 hrs)、暗(7 hrs)のグロースキャビネット内におく。[7]以下、グロースキャビネット条件は同じ。
  3. 7 日間培養する。
  4. 切片を 1 つずつ、新しいカルス培地に植え継ぐ。[8]
  5. 7 日ごとに植え継ぎ、 2-5 週間選別培養を続ける。[9]

再分化 (Shoot Induction)

  1. カルスを再分化培地に植え継ぐ。[10]
  2. 7 日ごとに植え継ぎ、 3-7 週間培養を続ける。[11]

Shoot Elongation

  1. Shoot原基が形成されたカルスをshoot elongation培地に植え継ぐ。
  2. 7 日ごとに植え継ぎ、 3-6 週間培養を続ける。

Root Induction

  1. 1 cm 程度に成長したshootを切り取る。[12]
  2. Root induction培地に浅く突き刺し、 10 日間培養する。[13]

Root Elongation

  1. 円形プラントボックスにroot elongation培地 (約 40 ml) を入れ滅菌する。[14]
  2. 植物を浅く突き刺す。
  3. 3-4 週間、 26 ℃ (明、16 hrs)、 23 ℃ (暗、8 hrs) のグロースキャビネットで培養 (培地交換の必要はない) 。

鉢上げ

  1. 根が 1.5-2 cm 程度伸びたら、root elongation培地から取り出し、2 段重ねの角形プラントボックスにバーミキュライトを詰めたものに移植する。[15][16]
  2. 必要に応じて根粒菌を接種。[17]
  3. 蓋をして、少なくとも 2 週間程度グロースキャビネット内で育成する。
  4. 生育の様子を見ながら蓋をはずし、さらに 1－2 週間培養する。
  5. 植物が十分な大きさ (shootの長さ 3-4 cm) になったら、パワーソイル (クレハ園芸用培土) を詰めたビニールポットに移植し (1 個体/ポット) 、温室に出す。

コメント

  1. 抗生物質の濃度は重要なファクターであり、とくに再分化効率に大きく影響する。ハイグロマイシンは再分化の速度を遅くする傾向が強い。また、過度の選択圧は再分化個体のsomaclonal な異常の頻度を高め、再生個体の不稔率を高める。selection にbar を使うとその問題が少ないという情報がある (Stiller、投稿中) 。最適濃度はベクターの種類によっても当然変わりうる。同時に行う形質転換実験の種類が多くなければ、 2－3 段階の異なる抗生物質濃度で実験することが薦められる。
  2. 再分化には培地中のNH4+濃度が大きな影響をもつ。最適濃度は 10 mM とされており (Handbergand Stougaard, 1992) 、我々の経験でもこの濃度がベストであるが、カルスの緑色が薄く再分化が遅い場合には、濃度を高くするとよい場合がある。しかし、再生したshootの生長はNH4+によって阻害されるので、shootの再生を見たら直ちにshoot elongation培地に移した方がよい。
  3. 共存培養後の最初の 3-7 日間をselection なしのカルス培地におくことが行われているが (Stiller et al.、1997; 投稿中) 、我々の経験ではその必要はない。
  4. Gifu はアグロバクテリウムのstrain をあまり選ばない。AGL1 がベストと言われており、実際多くのグループはこれを用いている。しかし我々の経験ではLBA4404 とそれほどの違いはない。また、EHA101(または105) や、GV3101 も使用されており、問題はないと思われる。
  5. 植物の形質転換のためのバイナリベクターとしてCAMBIA 社 (オーストラリア) が 29 種のベクターキットを提供しており、G418 またはHygromycin 選抜を行う場合にはこれが便利である。
  • AGL1の入手先：
Robert A. Ludwig <ludwig@darwin.ucsc.edu >
Professor, Biochemistry & Molecular Biology Sinsheimer Laboratories
University of California Santa Cruz, CA 95064, USA
  • CAMBIAベクターキットの入手方法：
http://www.cambia.org.au/main/index.htm

解説

注
  1. ↑ 少ない数の種子で丁寧に行うことが大事。慣れればほぼ100%の種子が発芽する。種子滅菌法については、「ミヤコグサの基本実験系マニュアル」をあわせ参照のこと。
  2. ↑ プラスチック棒などでよく攪拌し気泡をのぞくとともに、固まっている種子をほぐす。 20 分後、硫酸をピペットで除き、大量の滅菌水で5回程度リンスしてから次のステップに移る。
  3. ↑ Falcon2070チューブなどを使い、 400-600 粒の種子に対して 25 ml 位を用いる。次亜塩素酸ソーダは古くなると有効塩素濃度が下がるので注意が必要。冷蔵庫に保存しあまり古くなったものは使わないか、濃度を濃くすることがよい。十分な滅菌が出来ない場合には、次亜塩素酸ソーダの前に 95 % エタノールで 30 秒程度処理すると改善される場合がある。
  4. ↑ 20分の洗浄後、水が黄色くならなくなるまで繰り返せばよい。
  5. ↑ 暗黒下 3 日間、連続照明 3 日間の方がよいかもしれない。しかし、Stillerらは全く光を与えていない。
  6. ↑ 菌は通常グリセロールストックから植菌する。培地のほぼ全面高密度に画線する。YMBにけんだくする際は、時々手で振り混ぜながら 20 分程度かけて菌を均一に分散させる。菌によっては分散に時間がかかる場合がある。菌の密度は 108-109 /ml 。しかし、液体培養の方が菌の密度をそろえ易いと考えられる。その場合は 2 晩YEPでmini-cultureしてstationary-phaseに達した菌液の、たとえば 50 μl を 4 ml のYEPに植菌して、 24 時間後の菌 (集菌して4-5 ml のWMBにけんだく) を用いるなどのやり方がある。
  7. ↑ Stougaardらの方法では連続明条件であり、実際連続明条件でも形質転換は行える。しかし、Stillerらは、 23 ℃、明/暗条件を推奨している。温度や光の条件は、グロースキャビネットによっても違う可能性があるので、試行錯誤によって最適条件を決めていくしかない。
  8. ↑ このとき、培地上に静かにおく。埋め込んだり、培地上で擦ったりすると組織が褐変化する率が高くなる。なお、ここから後はサージカルテープでシールしてもよい。
  9. ↑ 緑色のカルスが 1 mm 以上の大きさになったら、出来るだけ早く褐変化した組織と切り離す〔このステップはとても重要〕。
  10. ↑ 緑色カルスが形質転換体であることが確信できれば、あるいはカルス培地で 5 週間以上selectionされていれば、再分化培地から抗生物質を除いてもよい。そうでない場合は、最初の 2 週間はselectionを続ける必要があるかもしれない。この辺の加減は、カルス培地での抗生物質の濃度などにより、ケースバイケースである。
  11. ↑ 通常カルスの一部または全体が濃緑色になり、shootが分化し始める。再分化が始まったら次のshoot elongationに移る。再分化には 7 週以上かかる場合もある。再分化はミヤコグサ形質転換法のうちでもっとも問題の多い部分であり、効率は実験によってばらつきが大きい。再分化すれば、ほぼ 100 % が再生個体に至ると考えてよい。
  12. ↑ 1 つのカルスから数本のshootが出るので、それらをすべてroot induction培地に移すが、同一のカルス由来の個体はまとめて、他のものと識別できるようにしておく。
  13. ↑ 切り口がカルス化するが、この段階で発根はしないのがふつう。しかし誘導は 10 日間で充分。
  14. ↑ 直径約 6 cm 、高さ約 7 cｍ のプラスチック製プラントボックスの蓋に直径 5 mm 程度の穴をあけ、そこに通気用のテフロンシール (ミリポア) を貼る。やや小さいが通気用シールを貼ったものが市販されている (イワキ) 。）
  15. ↑ 角形プラントボックス (イワキ等) の底に直径約 7 mm の穴をあけ、綿製ロープを通し、別のボックスと 2 段重ねにする。下のボックスに培地を入れ、上のボックスをバーミキュライトで充たす。培養液はアルコールランプの要領で供給される。
  16. ↑ 1 ポットに 8－12 個体移植できるが、同じカルス由来の個体ごとに 1 ポットにまとめる。
  17. ↑ 培地はNiftal (B & D)の 1/2 を用いる。窒素を加えるが、無窒素で根粒菌接種の方が生育がよいことが多い。
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